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美宝胃肠胶囊维持胚胎小白鼠胃组织器官型植块存活及促进细胞增殖

2001年-11月-17日 来源:美宝国际集团
澳门新莆京8455.com中心实验室 徐荣祥,王运平,范然,王建虹,林海

[摘要]:目的:通过体外检测美宝胃肠胶囊(GIC)对胚胎小白鼠胃组织器官型植块生长的影响以探索GIC修复胃肠道粘膜损伤的机理。方法:体外培养胚胎小白鼠胃器官型植块,将植块分为两组:实验组和对照组。结果:实验组的胃器官型植块能很好地维持存活,从其中长出的单个细胞以及细胞克隆生长好、生长时间长。而对照组的胃器官型植块很快变性死亡。二者差异非常显著。结论:GIC能维持胚胎小白鼠胃器官型植块存活并促进来自植块的细胞和细胞克隆的生长,并且此过程可能与GIC激活上皮干细胞有关。

[关键词]:GIC;胃植块;生长

 

GIC Could Maintain Survival and Promote Cell Growth of Organ-Type Explants of Stomach of Mouse Embryo Xu rong-xiang,Wang Yan-ping,Fan Ran,etc。

Central laboratory, MEBO Global Group 100053

[Abstract]Objective: To research on the reparative mechanism of GIC on the lesion of gastrointestinal tract through testing the effect of GIC on survival and growth of organ-type explants of gastric tissue of mouse embryo. Methods: Cultured the organ-type explants of gastric tissue of mouse embryo in vitro, all the explants were divided into two groups: test group and control group. Results: Explants in test group could survive,single cells and cell clones from explants grew well and long. However, explants, cells and cell clones in control group died off after a short period of time. There was significant difference between two groups. Conclusion: MEBO could promote survival and growth of cells of gastric explants of mouse embryo and this process may be related to activation of epithelial stem cells.

[Key words]: GIC; gastric explant; growth  

  本实验的目的在于通过体外检测GIC对胚胎小白鼠胃组织器官型植块生长的影响以初步探讨GIC治疗粘膜损伤性疾病的机理。

 

  一. 仪器、设备、材料、试剂及实验动物

  超净工作台(北京半导体设备二厂)、培养箱(美国Forma)、超级恒温水浴及恒温电烤箱(重庆四达)、冰箱(江苏长岭)、倒置显微镜(重庆光学仪器厂)、显微成像分析系统(上海科瑞)、微波炉(广东Galanz)、微型计算机(北京沐泽)、光学显微镜(江苏光学仪器厂)、各种型号注射器、12孔培养板(丹麦NUNC)、50ml离心管、Eppendorf离心管、微量加样器(1000μl、200μl、20μl、10μl, 均为法国Gilson)、大小滴头、培养皿(φ5cm、φ6cm)、0.22μm微孔滤膜、针头滤器、各种眼科手术器械、显微外科器械、有盖三角烧瓶、有盖小试管、针头、GIC(本企业生产)、MEM培养基(美国Hyclone)、胎牛血清(杭州三利)、青霉素和链霉素(华北制药)等。

  实验动物:昆明种胚胎鼠。

 

  二. 实验方法:

  1.取一只孕16日龄的昆明种雌性小白鼠,颈椎脱臼法处死,先置于75%乙醇中浸洗一遍(2分钟),再置于75%乙醇中消毒5分钟;

  2.用眼科剪以及止血钳先剪开雌鼠的腹部皮肤,钝性分离至两侧,充分暴露腹壁肌肉,然后小心剪开腹壁全层,切勿伤及内脏及小鼠胚胎;

  3.剪开子宫,从宫腔中取出胚胎鼠,置入无菌平皿中;

  4.用双抗-冷PBS将胚胎鼠体表洗涤两次,每次1分钟;

  5.用显微外科剪刀将胚胎鼠的腹壁剪开,再用显微外科镊子夹起鼠胃,自贲门及幽门部切断,得到全胃,切掉并弃去近贲门的1/3,然后沿胃大弯处纵行切开鼠胃,充分暴露胃粘膜;

  6.用双抗-冷PBS将胚胎鼠胃连续洗涤两次,每次1分钟;

  7.将鼠胃置于含双抗的MEM培养液中浸洗2次,每次1分钟;

  8.将鼠胃剪成极小的器官型植块,面积约1mm×1mm;

  9.将植块置于12孔培养板的培养孔中央,每孔5块,间隔约2mm,布局合理,粘膜面向上,轻轻按压每块植块,使其紧贴培养板的表面;

  10.沿培养孔的边缘,缓慢加入约0.5ml的完全MEM培养液,勿使培养液与植块接触;

  11.将培养板置于37、5%培养箱中预孵育1小时;

  12.每孔加完全MEM培养液2ml,轻拿轻放,切勿使植块飘起,实验组加GIC;

  13. 实验组和对照组同步等量换液,每次去掉原液的1/2左右, 再加入相同量的新鲜MEM培养液;

  14.用倒置显微镜观察植块生长情况,用显微成像记录分析系统记录所观察的结果,并用计算机保存图像。

 

  三.实验结果

  细胞全程培养111天以内的报告:培养过程中未出现污染,实验组和对照组的胃组织植块刚开始培养时,能固定在培养孔中央,但随着培养时间的延长,植块先后慢慢脱离培养孔底部,游离飘浮于培养液中,但仍然贴近培养孔底部,并且大多集中于培养孔中央,植块的大小和形状几乎没有变化。这是培养前7天的情况。

  实验组植块和对照组植块在培养的前7天,组织块是完整的,但从培养的第8天开始,组织块就开始逐渐松解,并最终成为肉眼不易察觉的组织块,同时在实验组和对照组的视野中出现了单个细胞以及细胞克隆,在体外培养的第18天,对照组中的单个细胞以及细胞克隆逐渐变黑、皱缩、死亡、硬结,而此时实验组的细胞生长继续呈现良好的生长态势,单个细胞很多,在视野中到处可见,细胞类型大多为圆形或椭圆形,细胞核清晰,细胞是典型的活细胞,以培养孔中央数量最多,越靠近培养孔边缘细胞越少,边缘几乎没有,同时细胞克隆数也逐渐增多,每个克隆所含有的细胞个数也越来越多。这种明显的差别在其它器官型植块的培养中也曾经反复出现过,主要与营养物质供应有关。颜色变深往往是组织细胞变性坏死的前兆,说明单纯的MEM培养基无法提供给组织块合适而充足的营养,恰恰相反,GIC以其丰富的营养从一开始便能使组织处于一个与体内环境相差不大的生长环境中,充分保证了组织和细胞的活性。

  下面为实验组和对照组的对比图,从中可以看到差别是何等之明显。

图1 培养第24天。图1A为对照组,图1B为实验组。对照组中的胃组织细胞或细胞克隆已经死亡,实验组中显示的是细胞克隆。
图1A
图1B
图2 培养第30天。图2A为对照组,图2B为实验组。对照组中残留的是胃组织细胞碎片,实验组中是一个细胞克隆。
图2A
图2B
图3 培养第38天,图3A为对照组,图3B为实验组。对照组中残留的是胃组织细胞碎片,实验组中是一个细胞克隆,克隆中的细胞生长良好。
图3A
图3B
图4 培养第42天,图4A为对照组,图4B为实验组。对照组中残留的是胃组织细胞碎片以及细胞克隆碎片,实验组中是细胞克隆。
图4A
图4B

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